SPR(表面プラズモン共鳴)

SPRを用いたオブアルブミンの検出 

 SPRを用いた、オブアルブミン抗原―抗体反応の測定をご紹介i致します。
 Fig.1にオブアルブミン抗体の固定化から抗原―抗体反応までの流れを示します。ここでは、オブアルブミン抗体と金チップとを固定化する試薬として、PEG-NHS disulfideを用いました。 PEG-NHS disulfideは、disulfide基を介して金と、NHS基を介してアミノ基と結合するので金チップ上へタンパクを固定化するカップリング剤として非常に有用です。

Fig.1 Flow of antigen-antibody interaction
Fig.1 Flow of antigen-antibody interaction

 固定化には、フローセルとシリンジ、シリンジポンプから構成されるフロー系を採用しました。初めに、水、バッファーをフローして、センサーグラム(SPR角度)が安定していることを確認します。次に、1mg/mlのPEG-NHS disulfide溶液を5μl/minで30分フローし固定化します。SPR角度が変化し、PEG-NHS disulfideが金表面へ固定化されていることが確認できます。固定化後、余剰なPEG-NHSを取り除く為に、ランニングバッファーをフローし、洗い流します。このPEG-NHSが形成された金表面へ、200μg/mlの抗体溶液をフローすると、抗体は、金チップ上のPEG-NHSとアミド結合を形成し、固定化されます。再び、余剰な抗体をバッファーで洗い流し、1MのエタノールアミンをpH7〜9で数分間フローし、NHS残基をブロッキングすると固定化のプロセスが完了です。

 このようにして構築された抗オブアルブミン表面にオブアルブミンをフローすることによって、抗原―抗体の相互作用を評価することができます。5、10、20ng/mlのオブアルブミン溶液をフローしたときのセンサーグラムをFig.2に示します。濃度が増大するにつれて、抗原―抗体の相互作用によるSPR角度のシフトが増大していることが観察されます。

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Fig.2 Binding response sensorgram
Fig.2 Binding response sensorgram



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